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重大突破!晶能生物空間轉錄組測序服務第一批正式樣品完美收官
發布日期:2020-01-21瀏覽:

去年底,晶能生物10x Visium空間轉錄組業務正式上線,獲得了廣大的關注,臨近春節放假,今天小編得到技術部門給予的最新消息“第一批樣品已經做完了,結果很不錯”。

小編搜了下各大網絡平臺,貌似我們還是“全網第一家”官方正式宣布完成第一批正式樣品空間轉錄組測序全程服務的第三方測序服務平臺公司!

 


前段時間,為了便于各位老師進行課題設計和樣本準備,我們已經發布過關于10x Visium空間轉錄組測序的基本流程和介紹,參閱“新年賀禮:晶能生物全面開啟10x空間轉錄組服務”。

其主要步驟包括以下四個部分:

樣本準備

組織優化

空間轉錄組建庫及測序

數據分析

 

目前晶能公司技術部門通過接近1個月的摸索和實驗,通過第一批正式樣品的實驗過程,理論切合實際,整理完善出了一套針對空間轉錄實驗過程的關鍵控制點和經驗模型。今天就給大家分享一部分:

1、樣本準備階段


跟單細胞轉錄組類似,空間轉錄組的樣本準備也非常重要,會極大的影響后續的結果。所以樣本準備一定要非常謹慎,嚴格按照要求來做。

樣本準備的主要內容和步驟如下:組織速凍→OCT包埋→組織切片→RNA質控。

下文會分享一些我們在第一批樣品實驗過程中的一些資料和經驗。

 

1、組織速凍+OCT包埋

上圖就是本次第一批空間轉錄組正式樣品(已包埋處理)

 

2、 組織切片

公司擁有Leica組織切片機,樣品正在被小心翼翼切片

 

3、 RNA質控

上機RNA質控

質控曲線

 

在本次空間轉錄樣本處理期,實驗室部門前前后后摸索了40多個樣本范例,通過操作實驗總結出不同樣品質控核心關鍵點:

1. 樣品血液需要除去干凈,速凍盡量去除PBS殘留,避免發生結晶,會影響后續實驗。

2. 提前記錄標記好樣品的擺放位置,拍照確認組織的空間方位。

3. 較大的組織樣本在切片前需要進行組織劃分,以生成適合捕獲區域大小的樣本。

4. RIN值的檢測是關鍵的一個質控點,可用來確定樣本是否可以進行后續實驗。

5、........

6、.........

 


2、HE染色+組織優化


對于第一次進行實驗的樣本,都需要做組織優化。組織優化的目的是找到最佳的透化時間,以便正式實驗得到最好的效果。

其實驗流程為:固定-染色-明場拍照-組織透化-熒光cDNA合成-組織移除-熒光掃描,根據熒光強度判斷最優的透化時間。

實驗室大公開

美女實驗室小姐姐染色中

觀察影像

 

下圖右側是組織優化的示例結果,左上角第一個區域為陽性對照,不放組織切片,而是直接加入RNA,肯定帶有熒光。而右下角0分鐘的區域為不加透化劑的陰性對照,不發熒光。

出于樣本保密性,這里僅展示示例結果

 

以下內容是晶能技術部門經過操作實驗總結的組織優化核心關鍵點:

1. 組織優化過程需根據熒光強度來判斷最優透化時間,如取樣組織差異較大,需多次組織優化。

2、........

3、.........

 

 

3、建庫測序


空間轉錄組玻片包含4個捕獲區域(6.5 x 6.5mm),可做4個樣本。這四個區域可以做同一個樣本的重復,也可以做不同類型的樣本。

其簡單的驗流程是:固定,染色以及明場拍照→組織透化及cDNA合成→二鏈合成→cDNA擴增→文庫構建→高通量測序。

 

正式實驗相當于在組織優化的步驟上繼續往下完成文庫的構建和測序。做好前面的樣本準備和優化工作后,這部分出問題的概率就不大了。

文庫質檢合格,片段大小無誤,峰型正常

上機測序illumina NovaSeq 6000

 


4、數據分析


由于這部分涉及到大量保密問題,就不方便多闡述,生信部門也是天天加班,我看小哥哥們頭發又少了一些(變禿了,也變強了~)。

 

簡單闡述下空間轉錄數據分析的基本:

目前使用的分析軟件主要是Space Ranger 1.0.0,輸入的文件除了常規的下機數據,還需要前期HE染色的圖片,JPG和TIFF格式的都可以。

 

通過分析主要可以得到基因表達矩陣和空間轉錄組的聚類結果,且可以對不同類型細胞進行差異表達分析。通過可視化軟件Loupe Browser 4.0.0可以對分析得到的結果進行更精細的比較和分析。除了用于后續的分析之外,Loupe軟件還可以對space ranger無法處理的圖片進行手動基線校正,確保大部分染色結果都可以進行后續分析。

 

示例的分析結果如下:

 

部分分析結果圖:

 


在本次空間轉錄組測序樣品的處理,組織優化,文庫建庫和測序過程中,晶能生物技術部加班加點,最終克服萬難,成功完成第一批正式客戶樣品!
在此過程中也收集總結了諸多經驗和關鍵質控點,歡迎所有對空間轉錄組有興趣的老師,聯系我們銷售或技術服務人員。
咨詢熱線:4009200612

 

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